Читать онлайн
Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре
Ксилотрофные базидиомицеты в чистой культуре
ВВЕДЕНИЕ
Ксилотрофные базидиальные макромицеты представляют собой уникальную как с теоретических, так и с прикладных позиций, группу организмов. Исключительно велика роль дереворазрушающих грибов в природных экосистемах. Широко известным фактом является то, что основные запасы углерода аккумулированы контитентальной растительностью, и, прежде всего, лесами. Существуют данные, что только в лесном покрове России аккумулировано около 34 млрд. т углерода, поэтому леса следует рассматривать как естественный резервуар, регулирующий глобальный цикл органического углерода (Орлов, 1992; Замолодчиков и др., 2005). Естественная мобилизация депонированного в древесине углерода возможна путем ее биологического разложения. Последнее протекает при участии обширного комплекса организмов, образующих в природе ксилофильные сообщества. Несомненно, ведущая роль в этих процессах принадлежит дереворазрушающим базидиальным грибам, которые являются единственной группой организмов, способной к полной деструкции лигноцеллюлоз (Мухин, 1993).
В последние десятилетия ксилотрофные базидиомицеты уверенно заняли одно из ведущих мест в качестве объектов биотехнологии. Работы, проведенные в этом плане, касаются вопросов культивирования грибов-продуцентов пищевых белков, ферментов, других соединений с ценными свойствами. Выделение этих веществ стало основой для разработки лекарственных препаратов, биологически активных профилактических добавок. Фармакологическое действие макромицетов отличается большим многообразием (Краснопольская и др., 2002). Они обладают антимикробными, адаптогенными, иммуностимулирующими, седативными и прочими ценными свойствами, используются в качестве гипотензивных, капилляроукрепляющих, противоязвенных, противораковых и других средств. Исследовательские работы, проведенные в этом ключе в последние десятилетия, свидетельствуют о существовании значимых культуральноморфологических и метаболических штаммовых отличий у представителей различных видов базидиомицетов (Соболева и др., 2007). Поиск новых штаммов в природе, ведение селекционной работы с культурами являются перспективными приемами для максимального раскрытия потенциала организмов этой группы.
Вышесказанное свидетельствует об актуальности исследований биологии ксилотрофных базидиомицетов, целесообразности создания коллекций их чистых культур, располагающих достаточным объемом экспериментального материала и работы с природными изолятами, потенциально перспективными в биотехнологии.
Авторами создана коллекция мицелиальных культур базидиомицетов – представителей ксилотрофной микобиоты лесостепи Правобережного Поволжья. Коллекция включает 44 вида и 215 штаммов грибов, принадлежащих к разным систематическим и экологическим группам, в том числе в ней представлены редкие и занесенные в Красные Книги РФ и Пензенской области виды. Показаны возможности культивирования видов, независимо от их субстратной специфичности в природе, на субстратах, содержащих экстрагированные метоксилированные лигноцеллюлозные компоненты. С помощью разработанного метода скрининга отобраны штаммы ксилотрофных базидиомицетов, перспективные в качестве продуцентов стеринов. Получены положительные решения по заявкам на патентование оригинальной рецептуры субстратов и способа получения плодовых тел ксилотрофных базидиомицетов, перспективных в биотехнологии. Разработана биологически активная добавка к рациону сельскохозяйственных птиц на основе мицелия Ganoderma lucidum, которая апробирована в условиях крупнейшего птицеводческого комплекса Пензенской области (ООО ПТФ «Васильевская») и запатентована. Запатентован также способ хранения мицелиальных культур, обеспечивающий сохранение продуктивных свойств штаммов и генофонда редких видов, в том числе, занесенных в Красные Книги РФ и Пензенской области. Полученные данные относительно особенностей развития ксилотрофных базидиомицетов в культуре используются в процессе преподавания курсов «Экология» в ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА».
Глава 1 СТАТУС ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ В ЭКОЛОГО-МИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
1.1 Ксилотрофные базидиомицеты в коллекциях мицелиальных культур
Уникальные свойства грибов, такие их специфические особенности, как значительная питательная ценность, лечебные свойства многих видов, возможности получения ценных веществ и материалов на их основе, интересовали человечество с момента возникновения цивилизации. Другой стороной деятельности грибов, исследование которой представляло и представляет не меньший интерес для человека, является вред, наносимый грибами фито- и зоопатогенами, домовыми грибами и т.п. В связи с этим, изучение грибов началось с глубокой древности. Первое упоминание о грибах имеется уже у Теофраста (III век до н.э.). История культивирования съедобных и лекарственных грибов с целью получения плодовых тел насчитывает тысячи лет (Stamets, 1993; Chang, Miles, 2004; Wasser et al., 2002). Наиболее ярким примером в этом контексте служит трутовик лакированный, традиционно культивируемый в странах Востока.
Бесспорно, одним из крупнейших исследователей является немецкий миколог Антон Де Бари (1831–1888), автор многих фундаментальных работ, основоположник онтогенетического метода в микологии. Именно ему принадлежит первый цикл работ, посвященных вопросам биологии, строения, циклов развития, причин и механизмов старения многих видов грибов. Он работал с чистыми культурами грибов. При этом, в контексте исследований, связанных с чистой культурой, следует упомянуть имя немецкого ученого О. Брефельда (1839–1925), который занимался вопросами филогении грибов и может считаться основоположником метода чистых культур. О. Брефельд обосновал метод стерилизации питательных сред, разработал искусственные питательные среды, на которых проращивал споры головни. Он применил метод односпоровых культур раньше, чем это было сделано в бактериологии (Мирчинк, 1976). Этот момент в развитии науки о грибах Л.И. Курсанов в предисловии к русскому изданию книги Лилли и Барнетта «Физиология грибов» назвал переломным, причем перелом связан с внедрением метода онтогенеза, пришедшего на смену господствовавшего ранее описательноморфологического направления (Лилли, Барнетт, 1975). Этот новый подход потребовал искусственного выращивания изучаемых организмов, поскольку только таким образом можно проследить онтогенетические изменения грибов «от споры до споры». Однако вопросы физиологии освещались довольно слабо, ограничиваясь обсуждением потребностей грибов, растущих в культуре. Причем особенно пристально изучались паразитические, фитопатогенные грибы, что было связано с запросами практиков. На тот момент уже довольно активно исследовались вопросы физиологии процессов брожения, и, как считают, именно по этой причине дрожжи были изъяты из сферы микологии и отнесены к бактериологии, в которой физиологическое направление было развито более значительно (Курсанов, 1953).
При этом можно с полным правом отметить, что выделение и поддержание чистых культур, как прием работы с грибами, стало формироваться примерно к 80-м годам XIX века.
XX век ознаменовался бурным развитием физиологического направления в микологических исследованиях. Практические разработки были невозможны без теоретических, научных основ, в основе которых лежала работа, прежде всего, с чистой культурой. Эра антибиотиков, безусловно, стимулировала развитие данного направления: ближе к 50-м годам возник конкретный вопрос о практическом использовании чистой культуры в связи с общим прогрессом промышленного культивирования мицелиальных грибов для производства антибиотиков. К отечественным основоположникам физиологии грибов и работы с чистой культурой следует отнести З.Э. Беккер, в монографиях которой приводятся актуальнейшие и ценнейшие сведения о трофике, онтогенезе, особенностях метаболизма грибов в искусственных условиях (Беккер, 1988). Широкое хождение приобретает термин «штамм», который Большая Советская энциклопедия трактует как «…чистая культура определённого вида микроорганизма, у которого изучены морфологические и физиологические особенности» (БСЭ, 1969). Причем под «чистой культурой» понимали потомство одной единственной клетки, то есть клон (Malek, Fencl, 1966).
Теоретические исследования высших базидиомицетов также активизировались в этот период и были связаны с разработкой систематики, экологии, биологии грибов этой группы. Практические работы были направлены на получение мицелиальной биомассы для пищевых и кормовых целей, ценных биологически активных веществ, на использование мицелия для получения плодовых тел. В этот период внедрение и распространение в микологии получает метод глубинной культуры, использовавшийся до этого лишь в микробиологической промышленности. В результате появляются возможности глубинного культивирования не только гифомицетов-продуцентов антибиотиков, но и высших базидиомицетов (Eddy, 1958).
Исследователи приходят к пониманию принципиального значения установления сходства между химическим составом природных плодовых тел и культуральным мицелием, выращенным на элективных питательных средах. Делаются результативные попытки воздействием на условия культивирования добиться улучшения таких важных показателей культивируемого мицелия, как содержание белка, отдельных аминокислот и т.д. (Высшие съедобные базидиомицеты… 1983; Dijkstra, 1976). Многими исследователями отмечалась явная недооценка важности микологических аспектов проблемы глубинного культивирования высших базидиальных грибов, и, в частности, получения чистой культуры. По сведениям А.С. Бухало, вышеуказанная проблема привела к тому, что практически все штаммы базидиальных грибов (гименомицетов), отобранные в 50-70-е годы для промышленного культивирования, оказались несовершенными гифомицетами (Бухало, 1988). Это привело к некоторому пессимизму в оценке возможного использования высших съедобных базидиомицетов в качестве продуцентов биомассы и затормозило исследования в этой области. Более того, на тот момент возникла ложная концепция, утверждающая, что в культуре образуются физиологические мутанты с несвойственными высшим базидиомицетам спороношениями. Таким образом, возникла насущная необходимость разработки культуральных приемов идентификации (Nobles, 1948, 1965).
Именно в чистой культуре возможно и необходимо проведение описания культурально-морфологических признаков штаммов. Первая большая работа в этом направлении проведена чешским микологом М. Семерджиевой (Semerdgieva, 1965; Семерджиева, 1977, 1984). Работы этого автора, посвященные изучению культурально-морфологических признаков гименомицетов в условиях чистой культуры, вышли в свет значительно раньше, чем широко известная и рекордное количество раз цитируемая специалистами этого направления работа Дж. Сталперса (Stalpers, 1978). Работы Дж. Сталперса содержат примеры описания колоний высших базидиомицетов. Классификация типов мицелиальных колоний в соответствии с подходами этого автора активно используется при характеристике культуральноморфологических свойств различных штаммов.
Несомненно, огромнейший вклад в развитие приемов лабораторного и промышленного культивирования высших базидиомицетов внесли А.С. Бухало, И.А. Дудка, Н.А. Бисько, В.И. Билай. В их многочисленных монографиях содержится вся необходимая практическим микологам информация о работе с чистой культурой (Билай и др., 1983; Высшие съедобные базидиомицеты…1983; Бисько и др., 1986; Бухало, 1988; Дудка и др., 1992; Бисько и др., 2001, 2010). Для более полного описания культуральноморфологических особенностей штаммов А.С. Бухало предложено использовать расчетный показатель РК (ростовой коэффициент), который, кроме скорости роста учитывает и такие важные показатели, как интенсивность формирования воздушного мицелия. Сборники под редакцией В.И. Билай содержат описания методов изучения морфологии, физиологии, биохимии грибов, в том числе данные о жизнедеятельности культур грибов в экстремальных условиях (Методы экспериментальной микологии, 1973, 1982). Общим контекстом, объединяющим работы, выступает утверждение о том, что экспериментальное изучение высших базидиальных грибов стало возможным только благодаря разработке доступных методов получения чистых культур этих грибов. Этот момент в развитии экспериментальной микологии можно считать периодом окончательного осознания исключительного статуса чистой культуры.
Интенсификация микологических исследований в условиях чистой культуры в последней четверти XX века связана с развитием и распространением любительского и промышленного грибоводства. В этом контексте несколько иное понимание получает термин «штамм», который подразумевает в практическом грибоводстве чистую генетическую линию, которая может быть получена путем вегетативного иссечения изолята из плодового тела. Таким образом, возникает синонимика между понятиями штамм и изолят. Именно в этом направлении практической микологии возникают такие термины, как маточная, посевная культура. Так, в ряде рекомендаций по выращиванию посевного мицелия с целью использования в практическом грибоводстве, отмечается: «Штамм – чистая культура грибов, отличающаяся особыми признаками и ценными свойствами. Штамм размножают не спорами, а с помощью "чистой культуры" (она же стволовая, она же маточная культура), и здесь уже имеется в виду именно чистота в смысле генетической чистоты линии штамма» (Рекомендации…1983).
В наших исследованиях мы придерживаемся следующей трактовки определения «штамм»: чистая культура определенного вида, выделенная из базидиомы (или базидиом, растущих совместно), тканевым или споровым способом, для которой изучены культурально-морфологические свойства и особенности микроморфологии. В зависимости от способа выделения и прочих особенностей могут различаться ди- и монокариотические штаммы, тканевые и споровые изоляты.